唐英
[摘要]目的：慢性粒细胞性白血病（慢性粒细胞性白血病）是一种骨髓增生性疾病，其特征在于形成了BCR / ABL融合基因，该基因在9号和22号染色体上易位，编码具有酪氨酸激酶活性的融合蛋白肿瘤。导致造血干细胞异常克隆扩增，以及靶向酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的出现，导致95％的CML患者无病长期生存。
但是，伊马替尼的应用存在许多问题，最明显的是伊马替尼耐药。伊马替尼耐药性研究表明，可以使用约30％的耐药性。尽管已经描述了激酶结构域中的突变，但是许多在该结构域中没有突变的患者激酶也会产生耐药性，因此需要从其他角度研究耐药机制。
最近一项关于CML患者CpG岛甲基化的研究发现，几种基因（CDKN2B，OSCP1，PGRA，PRGB，TFAP2E等）的甲基化与CML患者的预后差和耐药性有关我明白了
表观遗传学主要从基因组修饰的角度研究基因表达调控的机制。产生的表观遗传变化并不意味着基因序列发生变化，DNA甲基化是表观遗传修饰的重要机制之一。MBD家族的重要成员。
因此，重要的是研究MBD2基因敲低对慢性粒细胞白血病细胞系的影响。
方法：利用CRISPR / Cas9技术设计基因编辑工具，构建质粒质粒去除MBD2基因，并将其转移至K562细胞系（人慢性髓细胞白血病细胞系）达到酶消化击倒的目的。
接下来，通过分类选择突变和野生型细胞系，并通过流式细胞术测序。
通过RT-PCR和Western印迹检查去除效果。
然后通过流式细胞术，细胞周期，CCK8方法和CFDASE染色检测细胞增殖。此外，集落形成和裸鼠致瘤实验分别用于检测细胞克隆形成和细胞致瘤性。
结果：使用CRISPR / Cas9技术成功构建了具有拆卸效果的MBD2工具质粒。通过电穿孔测序获得了被MBD2基因稳定敲低的K562细胞系。
通过对其生物学行为的研究，MBD2基因被破坏后，K562细胞的凋亡没有明显改变，但是细胞显示出明显的周期终止，其中大部分被阻滞在G0期。我找到了G1增殖能力也被显着抑制，复制形成的能力减弱，并且裸鼠中形成肿瘤的能力也显着降低。
结论：CRISPR / Cas9技术可以建立具有统一细胞背景的基因去除模型。在慢性粒细胞性白血病细胞中，MBD2基因表达降低，肿瘤干燥减少。
该机制可能是由于去除了作为DNA甲基化前导序列的MBD2蛋白，导致DNA甲基化谱的异常表达。
[获得学位]：华中科技大学[等级]：硕士学位[特许经营等级]：2017[分类号]：R733。
72
下载全文
更多类似的文献
